引物合成服务

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。 亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

合成过程

三羊开肽生物引物合成 第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。 合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。

服务特色和优势

严格的质量监控,高纯度的品质保证: 三羊开肽生物拥有多种合成仪器,其中以BLP平台为主导,用于高通量的合成并搭配SpectraMax,全程监控合成的效率;此外我公司还有 ABI 3900和BioAutomation,可以大规模合成,专门用于一些特殊目的的合成。 除此之外,公司拥有多种型号的高效液相色谱仪,一次制备量可满足50nmol-50umol的合成级别,纯度可达到95%以上。

出货、发货速度快:

普通引物48小时内出货, 国内1-2天到货。 (DSL和OPC纯化引物(60base以下)发货时间一般1-2天;PAGE和HPLC纯化引物发货时间一般2-3天;修饰引物5-7发货时间一般为3-5天) *均为工作日 公司采用气相氨解仪进行氨解,采用高温高压氨气进行氨解,避开了普通氨水氨解,加快了氨解速度,减少了氨水氨解过程中微量物质的残留和污染,将对引物的损害降低到了最低程度;另外我们的氨解采用自动控制,减少了氨解过程中的偶然偏差。

多种纯化方式:

DSL纯化/ C18脱盐纯化; OPC纯化; PAGE纯化; HPLC纯化; 采用冻干技术,产品稳定性高: OD合成量高的引物,我们采用冻干技术,相比同行的真空加热干燥,可以很大程度减少对产品的损伤;冻干的引物在-20°C能够稳定长达一年,在4度能够稳定几个月。

合成多种修饰引物:

我公司可以提供多种高品质荧光修饰,包括双标记荧光探针,稀有碱基,硫代修饰,磷酸基团,各种荧光集团修饰,生物素,地高辛等。

强大的技术支持:

随时为您解答引物出现的任何问题。

纯化方式介绍选择
常见修饰物的应用
纯化方式 纯化原理 优点 缺点 适用范围
DSL纯化 采用最新的biolytic气象氨解仪,在高纯氨气水蒸汽混合物的气相氨解环境下将连接在CPG上的引物切割洗脱下来,能有效地去除盐分,经过有机溶剂的梯度洗脱能去除部分的杂质。 相比传统的液相氨解高效,快速,无交叉污染,所有纯化方法中最简单的一种。 不能有效去除比目的片段短的小片段,前提是合成效果很好时才能选用此法。 PCR扩增、亚克隆、点突变、全基因合成及DNA测序等。
OPC 纯化 利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂,合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT片段的吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT的片段吸附能力弱从而被洗脱,然后用酸脱去吸附在OPC柱上DNA的DMT,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。 方便、快捷 其专一性吸附DMT能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小,特别是对长于40个碱基以上的 片段纯化效果不好 PCR,引物的关键在于5′序列 如限制性酶切位点;指定位点突变;合成文库时的第一条链cDNA合成;克隆接头的产生。
PAGE 纯化 利用不同长度序列DNA在凝胶中迁移率不同来分离目标序列和失败序列,从而提供高纯度的目标引物。 对长链引物(大于40 mer)的纯化特别有效。本公司采用和C18反相柱连用,毛细管电泳,纯度大于85%。 纯化效果好,尤其是纯化长链效果好。 自动化程度低,纯化过程中引物损耗较大,发货周期相对较长。 40 mer以上的普通引物的纯化最有效方式;用于定点突变、克隆;蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗与诊断用途。
HPLC 纯化 HPLC根据吸附介质分为反相柱和离子柱。反相柱是根据疏水性的差别来分离的,即疏水性更强的长片段比短片段吸附能力更强,后出峰;离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷,较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱内流动得慢,从而依次将不同片段洗脱出来。 自动化程度高,省人力,纯化效果好,纯度可达 99%以上,特别是在标记引物和特殊修饰探针纯化中效 果好。 纯化量小,不能纯化长片段,设备昂贵。 <50 mer的普通引物的纯化,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗用途;修饰引物的纯化;商业化的诊断引物或探针。
  • 磷酸化(Phosphorylation): 5’磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。 磷酸化可抗外切酶消化的相关实验中,也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
  • 生物素(Biotin):生物素修饰能够耐受热和pH。生物素化的DNA能够成功的转化进入细菌 。 引物生物素标记,可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
  • 地高新 (Digoxigenin):地高新是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质,因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源, 所以抗地高新抗体不会结合到其他生物物质。地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置。杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测, 这个抗体一般会与碱性磷酸酶,过氧化物酶,荧光素或胶体金偶连。或者没有偶连的抗地高新抗体但偶连的抗抗体。 地高新标记的探针可用于各种杂交反应,如DNA-DNA杂交(Southern blotting),DNA-RNA杂交(Northern blotting)斑点杂交(Dot blotting ), 克隆杂交,原位杂交以及酶联免疫分析(ELISA)。
  • 内部氨基修饰:主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离,可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)。
  • 5'氨基修饰:可用于制备功能化的寡核苷酸,广泛应用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种, 前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物,后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记,尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
  • 3'氨基修饰:可用于制备功能化的寡核苷酸,广泛应用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种, 前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物,后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记,尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
  • 巯基(Thiol):5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。 例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。 5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体(5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。 用5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基(trityl),而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
  • Spacer:Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用,主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。 C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔,或“替代”一个序列中未知的碱基。 3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。
  • 硫代(Phosphorothioate):硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。 您可以选择全硫代,但随着硫代碱基的增加,寡核苷酸的Tm值会降低,为了降低这种这种影响, 可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰,通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
  • 脱氧脲嘧啶 (DeoxyUridine,dU):脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。 每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。
  • 脱氧次黄嘌呤(deoxyInosine,dI):脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基, 虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。 脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下,脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。
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